1.1什么是单细胞测序
单细胞全转录组测序技术是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项新技术。通过对单个细胞的mRNA进行逆转录和PCR扩增，使用高通量测序手段，对单细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路分析等分析，从而解决早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等领域中存在的起始样本量较低或细胞异质性的问题，并展开研究。
1.2产品功能
单细胞转录组测序技术主要用于在全基因组范围内挖掘基因调控网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞、肿瘤细胞及胚胎发育早期的细胞群体。单细胞转录组分析有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调控网络。
1.3技术优势
近年来，已有多种单细胞测序技术及平台应用而生，10x Genomics凭借其高细胞通量、短项目周期及低成本脱颖而出。
1 超短建库时间 从细胞悬液到cDNA文库仅需1天
2 高细胞通量，可一次捕获数万个细胞；
3 高捕获效率 单细胞捕获效率高达65%；
4 单个细胞
5 价格优惠 相较于其他单细胞平台，价格大幅优惠。
1.4实验简介
1.4.1实验原理
基于10×Genomics平台，通过快速高效的单细胞标记、测序和分析，获得单细胞水平的数字化基因表达谱，可对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制单细胞表达图谱。 应用：这一技术可广泛应用于癌症，免疫，干细胞，胚胎分化发育，神经分化发育等研究，为疾病或遗传发育等研究等提供了的良好机遇。
1.4.2 实验流程
获得样品后，首先组织样品要经过研磨处理，将组织块处理成单个细胞。其余样本收集分装，直接送测序。
1.5 项目执行时间
从样品的检测合格开始，到建库测序及数据分析出报告，大约需要30天：
从实验启动到送测序完成需要1个工作日，如果样品需要进行组织完整性鉴定，则额外需要3个工作日，共计4个工作日。前期质检结果我们会在第四个工作日之前以书面的形式通知销售和科研助理。
二、样本准备
2.1 样本要求
2.1.1 DNA
a. 片段>100kb（至少大于50k），总量>2.5μg
b. 客户样品、样品完整信息单
c. 送样前一天通知实验人员，准备时间进行细胞处理
2.1.2组织样本
a. 新鲜的组织 ，0.5g 以上
b. 客户样品、样品完整信息单
c. 送样前一天通知实验人员，准备时间进行细胞处理
2.1.3血液样本
a. 全血>400μl以上
b. 客户样品、样品完整信息单
c. 送样前一天通知实验人员，准备时间进行细胞处理
2.1.4单细胞样本
a. 总量> 6×10^5 个，细胞直径< 30μm
b. 客户样品、样品完整信息单
c. 送样前一天通知实验人员，准备时间进行细胞处理
三、样本运输
3.1样品包装：所有的容器应当用parafilm进行封口
3.2 样本标识
在容器表面写清样品名称，且与信息单上一致。不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息，将样品名称等 各种信息写在标签纸上，贴在管壁，外面再用透明胶带缠绕一圈(防止标签纸没有粘牢脱落，导致 样品无法应用)。
3.3 样本运输条件
1、运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的 薄厚有关(为更有利于保温，尽量选用大块的干冰，建议将样品用透明胶固定于冰袋上，防止干冰挥发导致样品降解)。
2、所有样品尽量保证48小时内运达。
3、销售请于寄送前告知实验室人员和科研助理，所有样品不支持到付。
四、应用案例
案例1 10x单细胞转录组测序应用于小鼠肠道干细胞以研究不同群体间的关系
Yan K S, Gevaert O, Zheng G, et al. Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity. （Cell Stem Cell ,IF:23.393,2017）
肠道具有明显的再生潜力，肠道干细胞（ISCs）位于增生性隐窝，可产生祖系细胞，这些祖细胞具有多谱系细胞分化、维持稳态及创伤性再生的能力。作者对小鼠ISC群体进行10x单细胞转录组测序以研究不同群体间的关系。结果显示 multiple cycling ISC群体的转录组与 Lgr5+ISCs非常相似，但是Bmi1-GFP+细胞是不同的，含有丰富的内分泌（EE）标记，包括 Prox1。在体外Prox1-GFP+细胞会一直保持克隆生长，在体内谱系追踪结果显示Prox1+细胞在稳态维持和受到辐射损伤后会保持长期的克隆。细胞聚类分析将Prox1-GFP+细胞分成两个亚群，一个与成熟内分泌细胞（EE）类似，另一个的内分泌基因表达水平较低但是却与tuft细胞标记基因（Lgr5、Ascl2）共表达。本研究数据显示内分泌谱系细胞，包括成熟内分泌细胞，具有肠道干细胞活性。
案例2 10x单细胞转录组测序鉴定18787个人类诱导多能干细胞的不同起始亚群
Single-Cell Transcriptome Sequencing Of 18,787 Human Induced Pluripotent Stem Cells Identifies Differentially Primed Subpopulations.（bioRxiv, 2017）
对于多功能细胞，转录表达谱是发现调控未分化状态关键基因和基因网络的中心。但是，对多能性细胞培养中体现出的细胞态异质性并没有转录水平上的描述。由于细胞间基因表达具有高度异质性，单细胞RNA测序(scRNA-seq)可以用来加深我们对个体多能细胞功能的理解。本文作者通过10x 单细胞转录组测序研究了18787个人WTC CRISPRi 人诱导多能干细胞。根据多能态，将人群分为四个亚群：静止(48.3%)，增殖(47.8%)，分化早期(2%)，分化晚期(1.1%)。研究人员确定了为每个亚群定义的新基因和其通路，并且开发了一个多基因预测模型对单细胞进行亚群分类。该研究为扩展对多能细胞复杂性的理解提供了一个基准单细胞数据集。
案例3
Dissecting meiotic recombination based on tetrad analysis by single-microspore sequencing in maize. (Nature Communications, 2015)
遗传重组是物种进化的重要动力，而且作物遗传改良中扮演重要的角色。四分体是一次细胞减数分裂后的直接产物，是遗传重组分析的理想材料。分离四分体的四个小孢子机芯单细胞基因型分析是研究遗传重组机制的方案。严建兵教授课题组分离了玉米四分体的四个小孢子，并进行单细胞测序分析。通过重组分析显示，基因区比基因间隔区更容易发生重组，而且在基因的5’和3’调控区重组发生更为常见。作者证明了植物中存在较强的重组负干涉和复杂的染色单体干涉以及环境因素能够显著影响重组频率等重要的遗传学现象。本研究对玉米重组规律有了新认识，为作物遗传育种提供了有价值的信息。
上一篇：单细胞悬液制备——实验样本
